HPLC cihazı, bir mobil faz (sıvı) ve bir sabit faz (katı veya sıvı) kullanarak bileşenleri ayrıştırır. Numune, mobil fazın içinden geçerken, bileşenlerin farklı hızlarda hareket etmesi sağlanır ve böylece ayrıştırma gerçekleşir. Bu ayrıştırma, bileşenlerin farklı kimyasal özelliklerine dayanır.